[VIP第1年] 指数:3
Claudin***靶点简介胃*是一种在世界范围内常见的**之一，在发达国家**相关的死亡因素中胃*占第四（男性）和第五（女性）。大多数的的胃*患者在确诊后已经处于晚期阶段。早期胃*通过胃部切除手术可能被***，复发率仍然达到50%。目前为止，晚期胃*是不可***的，经过化疗中位生存期为8-10个月。研究多重化疗方案用于提高响应率和耐受性，然而5年生存率仍然是渺茫的。免疫疗法和靶向***，例如曲妥珠单抗（trastuzumab）、雷莫芦单抗（Ramucirumab）和激酶***剂，已经用于各种**的***包括胃*。随着靶向疗法的出现，靶向不同路径的各种分子用于胃****上，，在正常的组织中*表达在分化的胃粘膜上皮细胞上，使得开发针对***性抗体具有更大的***潜力、更低的毒性，有更大的比较好用药剂量空间。Claudin蛋白Claudin蛋白由ShoichiroTsukita及其同事在1998年发现，北京人源Claudin18.2蛋白****，是细胞紧密连接的重要分子。其构成了细胞旁屏障，控制细胞间分子的流动。其结构如图1所示，北京人源Claudin18.2蛋白****，该分子具有四个跨膜结构域，NH2端和COOH端位于胞内，北京人源Claudin18.2蛋白****。不同的Claudin蛋白表达在不同的组织，与各自组织**发生具有相关性，Claudin-1在结肠*上，Claudin-10在肝细胞*上，Claudin-18在胃*上具有相应的临床价值。
25mmol/LTris、192mmol/LGlycine、20%甲醇)，100V恒压lh，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含mol/LTBS、)室温洗3次，浸入封闭液(含2%BSA的TBST)中37°C，1h，洗涤液(TBST)室温洗3次，加山羊抗人(Santacruze公司)，37'C孵育1h，TBST室温洗膜3次，加入兔抗山羊IgG-HRP二抗(中杉公司)，37。C孵育1h，TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入OPD显色液中，室温避光显色10min，蒸馏水冲洗终止反应(参见图3)。(3)融合蛋白的纯化和复性取含，5000rpm离心10min，收菌，超声裂菌；4°C,12000rpm，离心20min，分别收集上清液和沉淀。将沉淀用6mol/L尿素溶液重悬，4'C下静置溶解。将溶解的沉淀和上清分别取样进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析。在证实目的蛋白以包涵体的形式表达后，用Ni-NTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀(包涵体)。按1g菌体加10mL裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌。12000rpm,离心15min，弃上清，1g沉淀加10mL6M尿素，，MTris(pH)。4"C搅拌2h，12000rpm，离心15min，共离心2次，收集上清待用。用6M尿素，MNaH2P04，MTris()充分平衡Ni柱，先用含10mmo1咪唑的6M尿素，,()洗脱杂蛋白。
再用含250mmol咪唑的6M尿素，,(pH8,0)洗脱目的蛋白。收集洗脱峰，纯化产物透析至2M尿素，，Tris(pH)复性，终浓度lmg/ml。***透析入(pH)中，PEG8000浓縮后，用Bradford法测定蛋白浓度(参见图2)。三、动物模型实验(1)小鼠分组与免疫方案分组将24只BALB/c小鼠分成4组，于小鼠背部皮下按照口107个/只，每组6只分别接种胃*MFC和胰腺*MPC-83细胞各2组。每个肿瘤细胞接种2组荷瘤小鼠，待成瘤后，按照常规免疫方法分别注射盐水。在第4次免疫后10天摘眼球**，测定血清中抗。免疫方案背部皮下多点注射；rhClaudinl8,2:40Wg/只+生理盐水总体积为200txL/只，分别隔周注射；第4次，使用:40ug/只+生理盐水200wL/只，腹腔注射。(2)￡03八法测定血清抗(:1&11&在第4次免疫后10天**，收集抗血清，通过间接ELISA测定血清抗。每个样品均设6个孔。ELISA实验方法如下所需溶液的配制a.包被缓冲液碳酸盐缓冲液取Na2C03:g(终浓度mol/L)，NaHC03:(终浓度mol/L)，纯水定容至200mL()，有效期两周。b.洗涤液含Tween-20的PBS()。c.封闭液含1%BSA的洗涤液。d.稀释液含BSA的洗涤液。e.底物缓冲液Na2HP04*12H20:g，柠檬酸mL(pH)。f.底物显色液OPD:8mg，3%H202:30uL。h.终止液H2S04:lmol/L。
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